興奮性が強化されているが、若者と成人の苔状線維末端における活動電位波形は成熟している

Apr 29, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 290 (2023) この記事を引用

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成人生まれの顆粒ニューロンは、未熟な臨界期を経て、体細胞興奮性と求心性可塑性の亢進を示し、これにより海馬の学習と記憶において独特の役割が与えられると考えられています。 今回我々は、マウス海馬スライスのパッチクランプ記録を用いて、若いニューロンの過剰興奮がCA3錐体ニューロン上のシナプス前苔状線維末端でも観察されることを示す。 しかし、活動電位波形は体細胞よりもブートンの方が早く成熟し、未熟な段階で遠心性機能が急速に機能していることを示唆しています。

成人の海馬の神経新生は、認知と感情的行動に重要な役割を果たす新しい歯状回ニューロンのプールを生成します1,2。 新しいニューロンの細胞特性は発生段階と密接に関連しており3、機能理論の中心となるのは「臨界期」の概念であり、未成熟ニューロンは独特の構造的および生理学的特性の組み合わせを通じてネットワークシグナル伝達に重要な貢献をします。 たとえば、未熟なニューロンは入力シナプスで示差的な可塑性を示し4、5、6、7、8、9、10、それらの生存は経験によって調節される11、12、13、14、15、16、そしてそれらは体性興奮性の強化4,17。 したがって、多くの理論は、これらのさまざまな形の発生可塑性が、記憶プロセス中に新しいニューロンがどのように動員され、外部刺激に同調するかを形作る可能性が高いと提案しています18、19、20、21、22。

成人生まれのニューロンの求心性および体性特性に関する豊富なデータにもかかわらず、遠心性特性については比較的ほとんど知られていません。 歯状回は、まばらだが非常に強力な苔状線維軸索を介して領域 CA3 に突き出ています。 苔状線維終末は脳内で最大のものの 1 つであり、記憶エンコード中に CA3 錐体ニューロンを動員する際に重要な役割を果たすと広く信じられています 23,24 が、検索中の記憶識別にも寄与します 25。 成人生まれのニューロンは、下流の CA3 錐体ニューロンと機能的接続を形成し 26、苔状線維軸索は急速に伸長し 27、臨界期のいくつかの形態の可塑性を示すという証拠があります 28,29。 しかし、新生児ニューロンの出力における電気的特性については何もわかっていません。 シナプス前活動電位の形状とダイナミクスがカルシウムの流入と神経伝達物質放出の有効性を決定し 30,31 、したがって CA3 錐体細胞ネットワークへの情報伝達に大きな影響を与える可能性があるため、これらの詳細は重要です。 苔状線維末端における活動電位シグナル伝達は、顆粒細胞体からの興奮性シナプス後電位の受動的拡散によって調節されるため 32、ブートン興奮性の臨界期の違いもシナプスの有効性に影響を与える可能性があります。

これらの疑問に答えるために、今回我々は、成人生まれの歯状顆粒ニューロンと海馬のCA3領域の出力シナプスにある個々の苔状線維末端における膜興奮性と活動電位特性の発達を調査した。 我々は、雌雄の Ascl1CreERT2 マウス 6,33 を使用して、成人生まれおよび新生児生まれの歯状顆粒ニューロンを誕生させ、tdTomato 陽性細胞体およびブートンからのパッチクランプ記録を使用して、電気シグナル伝達の受動的および能動的特性を測定しました。

私たちの手の中で、若い成人生まれのニューロンが既知の臨界期特性を示したことを検証するために、まず固有興奮性の成熟の時間経過を決定しました。 特定の年齢（具体的には、タモキシフェン注射後の日数、DPI）の個々の顆粒細胞が、パッチクランプ電気生理学的記録の対象となりました（図1a）。 以前の研究6,33と一致して、若い（4〜6週）成人生まれの顆粒ニューロンでは入力抵抗が増加しましたが、細胞が8週齢以上に成熟するにつれて減少しました（図1b〜d）。 電流クランプ実験では、若い成人生まれのニューロンは、より少量の電流注入で活動電位を発火させました（図1e、f）。 活動電位を誘発するための電流閾値は細胞年齢とともに増加し、新生児生まれの細胞および成熟した成人生まれのニューロンの閾値と収束しました34（図1f、g）。 さらに、若い成人生まれの細胞と成熟した成人生まれの細胞では、活動電位のピーク振幅が小さく、半減期が長くなりました（図1h–k）。 成体で生まれた細胞とは対照的に、新生児で生まれたニューロンの電気的特性は同じ時間枠にわたって一定であり（図1d、g、i、k）、これは時間依存的な違いが動物の年齢の変化によるものではないことを示しています。 まとめると、これらの結果は、未熟なニューロンがより興奮しやすく 4,33 、体細胞区画で未熟な活動電位波形を表示する臨界期を実証した以前の研究と一致しています 33,35。

Ascl1Cre マウスの出生日のニューロンから記録するための実験タイムライン (左) と、全細胞記録における tdTomato を発現する成体生まれの顆粒ニューロン (注射後 29 日) の蛍光顕微鏡写真の例 (右)。 b さまざまな年齢の顆粒ニューロンからの全細胞記録におけるテストパルス（10 mV、上）に対する反応（それぞれ赤と黒で成人生まれと新生児生まれ）。 若い成人生まれのニューロンでは定常電流が減少していることに注目してください。これは、未成熟細胞の高い入力抵抗と一致しています。 3 つの異なるニューロン グループについて B に示すような実験から導出された入力抵抗値 (c; 一元配置 ANOVA、P < 0.0001、F(2, 44) = 17; 4-6w vs 8 + w、**** P < 0.0001、ヘッジズの g = 1.6)、成人生まれの顆粒ニューロンの細胞年齢の関数としてプロットしました (d)。 成人生まれのニューロンでは、入力抵抗は細胞年齢とともに低下します (R2 = 0.37、P < 0.0001、F(1, 36) = 20)。 e 電流注入の異なる振幅に対する電圧応答を示す 3 つの異なるニューロンからのトレースの例 (500 ミリ秒、上)。 若い成人で生まれた顆粒ニューロンは、より小さな電流に反応して活動電位を発火させることに注目してください。 f ニューロンの 3 つのグループに対する E のような実験から活動電位を誘発するために必要な最小電流。 細胞年齢の 4 週間と 6 週間の間には、ニューロンが過剰興奮する臨界期が存在することに注意してください (一元配置 ANOVA、P < 0.0001、F(2, 42) = 14; 4-6w vs 8 + w、** **P < 0.0001、ヘッジズの g = 1.7)。 g 成人生まれの顆粒ニューロンの細胞年齢の関数としてプロットされた活動電位を誘発するのに必要な最小電流。 古いニューロンは、活動電位を発火させるためにより多くの電流を必要とします (R2 = 0.42、P < 0.0001、F(1, 34) = 24)。 平均ピーク振幅 (h; 一元配置分散分析、P = 0.03、F(2, 42) = 3.8); 4-6w 対 8 + w、*P = 0.03、ヘッジズの g = 0.73) および半期間 (j; 一元配置分散分析、P = 0.0011、F(2, 42) = 8.1)。 3 つのグループの活動電位について、4-6w vs 8 + w、***P = 0.0003、ヘッジズの g = 1.4)、成人生まれのニューロンの細胞年齢の関数としてプロットしました (i、k; R2 = 0.13、 P = 0.03、F(1, 34) = 5.1 および R2 = 0.30、P = 0.0005)。 若年成人生まれのニューロンの活動電位は、高齢成人生まれのニューロンよりも振幅が小さく、持続時間は長くなります。 バーは平均±標準誤差を反映しています。

出力シグナル伝達が興奮性の年齢依存的変化によって変化するかどうかを調べるために、次に、生年月日顆粒ニューロンの個々の苔状線維末端から細胞内パッチクランプ記録を実行しました（図2）。 調べた全年齢範囲の細胞から、大きな苔状の繊維末端が見つかった。 ブートンのサイズを示すブートン静電容量は、電圧クランプ記録のテストパルスから推定されました30、36（図2b）、実験グループ間で差はありませんでした（図2e、f）。 一方、入力抵抗は、若い成人生まれの顆粒ニューロンの末端で増加し、細胞年齢と有意に相関していました（図2c、d）。 したがって、若い成人生まれのニューロンのボタンの膜は比較的未熟であり、これらのニューロンの体細胞コンパートメントの結果と一致しているが、入力抵抗の相対的な減少は体細胞よりもボタンの方が小さかった（平均Rin(8+w) /Rin(4-6w) = 0.66 対 0.46、それぞれ)。

a 成人生まれ（30 DPI）の顆粒ニューロンの苔状繊維ボタン（矢印で示す）からのターゲットパッチクランプ記録の前（左）と終了時（右）の蛍光画像、および対応するIR-DIC顕微鏡写真（真ん中）。 b 成人顆粒ニューロン（30 DPI、赤いトレース）または新生児生まれ（黒いトレース）のいずれかの顆粒ニューロンの苔状繊維ボタンからの全細胞記録で誘発されたテストパルス（-10 mV、上）に対する電流応答。 挿入図: ボタンのサイズは、容量性過渡電流の指数関数的フィッティングによって推定されました 30。 3 つのセル グループのブートンの B のテスト パルスによって引き起こされる定常状態電流から決定された入力抵抗値 (c; Kruskal-Wallis、P = 0.005; 4–6w vs 8 + w、*P = 0.04、Hedges のg = 0.83)、細胞年齢の関数としてプロットしました (d; 成人生まれのニューロンの場合、R2 = 0.18、P = 0.015、F(1, 30) = 6.7)。 入力抵抗は、顆粒ニューロンの体細胞記録の所見と一致して、若い成人生まれのニューロンからのボタンの方が高いことに注意してください（図1を参照）。 3つの細胞グループについて（b）の実験から決定された静電容量値（e;一元配置分散分析、P = 0.39、F（2、60） = 0.96、4〜6w vs 8 + w、P = 0.28）およびプロット細胞年齢の関数として (f; R2 = 0.09、P = 0.10、成人生まれのニューロンの場合 F(1, 30) = 2.9)。 グループ間でボタンのサイズに一貫した差異は観察されませんでした。 g 成人 (44 DPI、赤) または新生児生まれ (黒) ニューロンの苔状繊維ボタンからの全細胞記録の過分極または脱分極電流パルスに対する電圧応答の例 (500 ミリ秒、上)。 閾値を超えるパルスによって引き起こされる特徴的な単一活動電位に注目してください。 h gのような実験から活動電位を誘発するために必要な電流。 生後 4 ～ 6 週間の成人生まれのニューロンのボタンは、興奮性の亢進と一致して、より少ない電流で発火したことに注意してください (一元配置分散分析、P = 0.005、F(2, 61) = 5.8; 4 ～ 6 週間 vs 8 + w、**P = 0.004、ヘッジズの g = 1.2)。 i 成人および新生児生まれの顆粒ニューロンからの苔状線維ボタンの細胞年齢の関数としてプロットされた活動電位を誘発するために必要な電流 (成人生まれのニューロンの場合、R2 = 0.22、P = 0.005、F(1, 32) = 9.0) ）。 バーは平均±標準誤差を反映しています。

次に、電流クランプ記録で電流を注入することにより、ボタンの興奮性を直接測定しました。 ブートンのすべてのグループは、電圧変化の顕著な整流と単一の活動電位のみの発火という特徴的な表現型を示しました（電圧活性化カリウムチャネルの高発現による30、37）（図2g）。 平均V-I曲線の傾きは、若い成人生まれのニューロンからのボタンの方が急であり、入力抵抗の上昇と一致しています（図S1）。 体細胞記録の結果と同様に（図1）、若い成人生まれのニューロンからのブートンは、より少ない電流注入で活動電位を発火させ（レオベースがより低い）、この最小電流閾値は細胞年齢と正の相関がありました（図2h、i）。 。 一方、ボタンが活動電位を発火する膜電位（AP閾値）は、グループ間で差がなく、成人生まれのニューロンの年齢にも依存しませんでした（図S2）。 体細胞記録とは対照的に、誘発された活動電位の波形はグループ間で類似しており、最大電流注入（70 pA）によって誘発された活動電位の振幅も半持続時間も細胞年齢の関数として異なりませんでした（図S3）。 ）。 これらの結果は、若い成人生まれの顆粒ニューロンの苔状線維終末が電流注入実験において過興奮性であることを裏付けた。これはおそらく入力抵抗が上昇し、したがってより小さな刺激がAP閾値に達する能力が高いためであると考えられる。

ニューロンの体体樹状突起コンパートメントは、閾値以下の求心性入力を統合して活動電位を生成し（通常、軸索近位で 38）、体細胞興奮性の強化により、若いニューロンが比較的弱いシナプス神経支配に反応して発火できるようになります 39。 対照的に、軸索ボタンは正行性活動電位によって活性化され 40、さらに苔状線維軸索には高密度の電位活性化ナトリウムチャネルがあり、これによりボタンの信頼性の高い活性化が保証されます 41。 したがって、我々は、短時間の電流注入による実験を行った（図３）。これにより、移動活動電位の波形と同様の活動電位波形が生成される４２、４３。 驚くべきことに、活動電位の振幅（図3b、c）も半持続時間（図3d、e）も、最大上昇率44（図S4）も、ボタンのグループ間で異なりませんでした。顆粒細胞の年齢と有意な相関があります。 ブートンからの記録に使用される高直列抵抗記録電極によるRCフィルタリングにより、高速活動電位の違いが見逃される可能性があるという懸念から（方法と図S5を参照）、22°Cで追加の実験を実行しました（図S6）。 。 活動電位はすべてのグループで大きく、これは遅い信号のフィルタリングが少ないことと一致しています（ただし、生物学的要因も温度の上昇に伴うAP振幅の減少に寄与している可能性があります45）が、グループ間で波形に違いは観察されませんでした（図S6）。 これらの結果は、若い成人生まれの顆粒ニューロンのボタンの膜は（入力抵抗の点で）未熟であるにもかかわらず、それらの構造の活動電位は成熟した表現型を持っていたことを示しています。

a 短時間の電流注入（200 pA、1 ms）によって誘発された成人（30 DPI、赤）または新生児生まれ（黒）の顆粒ニューロンからの苔状線維ブートンに記録された活動電位の例。顆粒ニューロン42,43。 平均ピーク振幅 (b; 一元配置分散分析、P = 0.10、F(2, 64) = 2.4; 4 ～ 6w 対 8 + w、P = 0.92) および半持続時間 (d; 一元配置分散分析、P = 0.92) 3 つの細胞グループのブートンで誘発された活動電位の 0.22、F(2, 64) = 1.5; 4-6w vs 8 + w、P = 0.19)、細胞年齢の関数としてプロット (c、e; R2)成人生まれのニューロンの場合、それぞれ = 0.06、P = 0.14、F(1, 32) = 2.3 および R2 = 0.03、P = 0.36、F(1, 32) = 0.87)。 グループ間で一貫した差異は観察されず、未熟な成体生まれの顆粒ニューロンの出力ボタンでの成熟した活動電位波形と一致していることに注意してください。 バーは平均±標準誤差を反映しています。

海馬の苔状線維末端における活動電位の注目すべき特性は、反復的なシグナル伝達による周波数依存の波形の広がりであり、これは活動電位の高周波列中の伝達物質放出の促進に寄与していると考えられている 30。 さまざまな発達段階における成人生まれの顆粒ニューロンの苔状線維終末の動的能力をさらに調査するために、電流クランプ記録で活動電位の高周波列を誘発しました（図4）。 若い成人生まれのニューロンのブートンでの活動電位の拡大は顕著であり、20 Hz または 100 Hz のブートン活性化の場合、成熟した成人または新生児生まれの顆粒ニューロンのブートンでの活動電位の拡大と変わらなかった。 総合すると、これらの結果は、若い（そうでなければ未熟な）成人生まれの顆粒ニューロンの出力における活動電位波形が、形状とダイナミクスの両方の点で成熟していることを示しています。

a 成人生まれの顆粒ニューロンからの苔状繊維ボタン内で 20 Hz で誘発された一連の活動電位 (30 DPI; 刺激 200 pA、1 ms)。 b 成人 (30 DPI、赤) または新生児生まれ (黒) の顆粒ニューロンからのブートン記録に重ねられた最初と 20 番目の活動電位。特徴的な広がりを示します。 3 つの細胞グループからのブートンの 20 Hz トレインにおける 20 番目と最初の活動電位の半持続時間の比 (c; 一元配置分散分析、P = 0.56、F(2, 64) = 0.58; 4–6w vs 8 + w、P = 0.44）、細胞年齢の関数としてプロットしました（d; R2 = 0.02、P = 0.41、成人生まれのニューロンの場合は F(1, 32) = 0.70）。 e 成人生まれの顆粒ニューロンからの苔状繊維ボタン内で 100 Hz で誘発された一連の活動電位 (30 DPI; 刺激 100 pA、2 ミリ秒)。 f 成人 (30 DPI、赤) または新生児生まれ (黒) の顆粒ニューロンからのブートン記録にオーバーレイされた最初と 100 番目の活動電位。 3 つの細胞グループからのブートンの 100 Hz トレインにおける 100 番目と最初の活動電位の半持続時間の比 (g; 一元配置分散分析、P = 0.12、F(2, 62) = 2.2; 4 –6w vs 8 + w、P = 0.29）、細胞年齢の関数としてプロットしました（h; R2 = 0.0002、P = 0.94、成人生まれのニューロンの場合は F(1, 31) = 0.007）。 ニューロンのすべてのグループのボタンは、高周波刺激により活動電位波形の同等の広がりを示すことに注意してください。 バーは平均±標準誤差を反映しています。

今回我々は、体細胞区画やニューロンへの入力シナプスで観察される臨界期シグナル伝達とは対照的に、若い成人生まれの顆粒ニューロンの出力端子における成熟活動電位の直接的な証拠を報告する。 これらの結果は、多様な顆粒ニューロン集団（若いニューロンと老人ニューロンなど）を含む歯状回がどのように情報を処理し、電気信号をCA3ネットワークに送信するかについて重要な意味を持つ。 例えば、成体生まれの顆粒ニューロンによるシグナル伝達への独特の寄与は、嗅内入力における差次的可塑性とそれらの入力の過興奮性細胞体での統合を通じて、歯状自体に限定されている可能性がある。 出力シグナル伝達の急速な発展により、その差動可塑性によって運ばれる情報が確実に下流の CA3 領域に伝達される可能性があります。 一方、ブートンの興奮性における臨界期の違いも機能的に関連している可能性があります。 歯状顆粒ニューロンの閾値下 EPSP は、おそらくシータ振動 46 中に、受動的に苔状線維末端に広がり、AP 誘発伝達物質放出を強化することができます (「アナログと AP コーディングの組み合わせ」32)。 したがって、若い成人生まれのニューロンとその苔状線維末端における入力抵抗の上昇（図1、2）が、潜在的により大きな軸索長定数（ラムダは膜抵抗の平方根に比例する47）と組み合わされて増加する可能性がある。体樹状突起シグナルの受動的拡散。 したがって、送信機放出のアナログ変調を強化すると、若い成人生まれの顆粒ニューロンの出力端子の計算レパートリーが増加する可能性があります。

苔状線維終端膜の興奮性が比較的未熟であるにもかかわらず、成熟した活動電位波形はどのように生成されるのでしょうか? 苔状ファイバー末端における電圧活性化ナトリウムおよびカリウムチャネルの高密度30,41は、受動的特性のわずかな違いにもかかわらず、AP波形を正規化するのに十分なコンダクタンスの安全率を提供する可能性があります。 顆粒ニューロン年齢の関数としてナトリウムおよびカリウムチャネル密度を直接（例えば、アウトサイドアウトパッチ記録48を用いて）測定する将来の研究は、この点を明らかにするのに役立つかもしれない。

以前、顆粒ニューロンと CA3 錐体ニューロンの間の興奮性シナプス後電流 (EPSC) は、細胞年齢 4 週間までに正常なサイズになることが示されています 29。 ただし、EPSC のサイズは、複数のシナプス前およびシナプス後因子によって決定されます。 たとえば、シナプス前終末では、特定の波形の AP がカルシウム チャネルを活性化して、カルシウム流入部位に近いシナプス小胞にあるエキソサイトーシス センサーを活性化するのに十分なカルシウム流入を生成する必要があります。 これらの要因のいくつか (AP 持続時間、カルシウム チャネルのサブタイプと電流、カルシウム チャネルとシナプス小胞間の空間結合) は、シナプスの発達中に変化することが示されています 31,49。 私たちの研究は、シナプス前シグナル伝達の重要な要素である AP 波形が、成体で生まれた顆粒ニューロンからのシナプス発達の初期に比較的成熟していることを示しています。

要約すると、臨界期の違いは、シナプス前生理学のすべてではなく一部の側面に存在することがわかります。 細胞体と同様に、若いニューロン末端は過剰に興奮しやすいです。 しかし、細胞体とは対照的に、若いニューロンの活動電位は成熟しています。 私たちの結果は、伝播速度や信頼性などの活動電位伝達の他の側面が、異なる発生段階の細胞で等しいかどうかを示していないことに注意する必要があります。 さらに、神経伝達物質の放出とシナプス後機能を制御する他の因子に発達上の変化があるかどうかは、将来の研究の対象となるべきである。なぜなら、出力シグナル伝達の有効性は、記憶のエンコード中にCA3錐体ニューロンがどのように動員されるかに影響を与える可能性が高いためである50、51、52。想起。

すべての手順はブリティッシュコロンビア大学の動物管理委員会によって承認され、動物の人道的かつ倫理的な扱いに関するカナダ動物管理評議会のガイドラインに従って実施されました。 Ascl1CreERT2 マウス (Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo; JAX 12882v53) および Ai14 レポーター マウス (Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze; JAX 7908)54 を The Jackson Laboratory から購入し、交配して子孫を生成しました。これらは、他の場所で記載されているように、Ascl1CreERT2 についてはヘテロ接合性であり、Cre 依存性 tdTomato レポーターについてはホモ接合性でした 33 (以下、Ascl1CreERT2;tdTomato マウス)。 マウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンドで飼育され、ケージ当たり５匹（床面積８２平方インチ）で飼育され、餌および水は自由に摂取でき、午前７時に照明が点灯する１２時間の明暗スケジュールで、Ａｓｃｌ１＋におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導した。前駆細胞とその子孫のマウスに、新生児期（生後 0 ～ 5 日、約 75 mg/kg、1 回の注射）または成体期（6 ～ 8 週齢、150 mg/kg 体重、 1 日 1 回の注射で最大 2 日間)、新生児ニューロンを永久に標識します33。 電気生理学実験には、生後 10 ～ 29 週の雌雄成体マウスを使用しました。

マウスをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、冷却切断溶液で心臓を灌流した。 灌流後、海馬の横方向スライス (厚さ 350 μm) を前述のように調製しました 55。 切断および保存溶液には、87 NaCl、25 NaHCO3、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、10 グルコース、75 スクロース、0.5 CaCl2、7 MgCl2 が含まれており、95% O2 および 5% CO2 で平衡化されています (pH は 7.4 に調整) HCl、~325 mOsm)。 スライスを 35 °C で少なくとも 60 分間保持した後、示されている 22 °C のサブセットを除き、生理学的温度に近い温度 (32 ～ 34 °C) で実験を実行しました。

パッチクランプ記録は、海馬の CA3 領域の歯状回または苔状線維末端の単一顆粒ニューロンから行われました。 記録は、125 NaCl、25 NaHCO3、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、25 グルコース、1.2 CaCl2、1 MgCl2 (mM) を含み、95% O2 および 5% CO2、約 320 mOsm で平衡化された人工脳脊髄液 (ACSF) で行われました。 記録を試みる前に、スライスをACSF中で少なくとも10分間洗浄した。

顆粒ニューロンの体細胞記録: 記録ピペットは 2.0 mm/1.16 mM (OD/ID) ホウケイ酸ガラス毛細管から製造され、(mM で) 120 K-グルコン酸塩、15 KCl、2 MgATP、 HEPES 10、EGTA 0.1、Na2GTP 0.3、Na2-ホスホクレアチン 7 (KOH を含む pH 7.28、約 300 mOsm)。 電流クランプおよび電圧クランプ記録は、-80 mV で実行されました。 高いシール抵抗 (数ギガオーム) と低い保持電流 (50 pA 未満) の記録のみが分析に含まれました。 電流クランプ記録の場合、直列抵抗とピペット静電容量は、それぞれアンプのブリッジバランスと容量中和回路で補償されました（容量中和は、電圧クランプで決定された Cp fast の約 70% に調整されました）。 ここでは、23 頭の動物からの合計 48 個の顆粒ニューロンの記録が報告されています。

苔状ファイバー端子の記録: 記録ピペットは 2.0 mm/0.7 mm (OD/ID) の厚肉ホウケイ酸ガラス管から製造され、抵抗値は約 15 ～ 20 MΩ でした。 ピペット溶液には、140 KCl、2 MgATP、4 NaCl、10 HEPES、10 EGTA、pH 7.28、~310 mOsm (mM) が含まれていました。 シール抵抗が 5 GΩ を超える記録のみが分析に含まれました。 全細胞の電圧固定記録は-80 mVで識別されたブートンから行われ、電流固定記録は-70〜75 mVで行われました。 可溶性 tdTomato 蛍光色素は、（特定のターゲティングを確実にするため）記録された苔状線維末端の検証に優れたシグナルを提供します。tdTomato の蛍光は、全細胞構成に達した後数十秒で消失します（図 2a）。これは、ブートンの透析と一致します。ピペット溶液５６． 注目すべきことに、マウスでここから記録された苔状線維末端は、ラットで以前に報告されたものよりも小さかった（ここでの全細胞静電容量の値が約0.35 pFから1.2 pF30および1.7 pF57と比較してください。また、記録のすべてのサブセットで入力抵抗が大きいことも比較してください）。 電流クランプ記録では、動作を最適に記録するために、アンプのブリッジバランス回路と容量中和回路をそれぞれ使用して、直列抵抗とピペット静電容量（Cpipette、厚肉キャピラリの使用によって最小化）を最大限に補償するように注意が払われました。小さな構造からの電位（電圧クランプ36で決定されたCpipette（fast）の104％（平均）に調整された容量の中和）。 必然的に、ある程度の残留容量と比較的高い抵抗の記録電極は、特にブートンのような小さな構造の場合、高速信号のフィルタリングにつながります36,58。予想通り、APのピーク振幅と半持続時間は記録の直列抵抗と有意に相関していました（図S5）。 ）しかし、ピペットの静電容量とは相関していません（静電容量の中和のため、すべての苔状繊維の記録がプールされています）。 重要なことに、ピペット静電容量も直列抵抗もグループ間で有意な差はありませんでした（図S5、平均Cpipette = 6.9、6.8、および6.9 pF; 平均Rs = 94、92、および95 MΩ（4〜6週、8週+週、および新生児））それぞれ録音）。 重要なことに、活動電位拡大測定は、記録システムの時間分解能の内部制御を提供します。AP 持続時間の差の測定は、以前に報告された拡大と定量的に同等です 30 (図 4)。これは、測定がダイナミック レンジ内にあることを示しています。私たちの録音システム。 ここでは、67 匹のマウスからの合計 93 個の苔状繊維末端記録を報告します。

データは、pClamp 10 ソフトウェア (Molecular Devices) によって制御される Multiclamp 700B アンプ (Axon Instruments) で取得し、10 kHz でローパス フィルター処理し、100 kHz でサンプリングしました。 データは、pClamp、IgorPro (Wavemetrics)、および Stimift59 を使用して分析されました。 入力抵抗は、電圧クランプでのテストパルス（顆粒セルの場合は10 mV、苔状のファイバー端子の場合は-10 mV）から測定されました。 顆粒細胞の記録では、電流注入ステップによって誘発された最初の 10 個の活動電位のピーク振幅と半持続時間が細胞ごとに平均化されました (図 1)。 苔状線維末端記録の場合、短時間の電流注入 (200 pA、1 ms) によって誘発された 3 つの別々の活動電位からのピーク振幅と半持続時間を平均化に使用しました。 ブートン サイズ (静電容量) を推定するために、テスト パルスからの過渡電流を、時定数 (t)、振幅寄与 (A)、および対応する静電容量を含む 2 つの指数関数の合計 [C = (At)/ΔV] でフィッティングしました。 、主要コンポーネントは端末の充電を表します30。 慣らし運転の直前にセルを取り付けた構成で記録したテストパルスを平均し、全セル構成で記録したテストパルスから差し引きました（各構成で 10 回の連続掃引）。 この重要なステップにより、セル全体のトレースから補償されていない残留容量の小さなアーチファクトが除去され、ブートン容量の最も正確な推定が可能になります 36。 AP閾値は、活動電位の変化率が20 mV/msに達する電圧として定義されました。 活動電位拡大分析の場合、データは各記録のトレインの最初の AP の値に正規化されました。 すべての値は平均値 ± SEM です。

グループ分析では、セルは 28 ～ 42 DPI の場合は 4 ～ 6w、56 DPI を超える場合は 8 + w に分類されました。 1 つの 27 DPI 苔状繊維端末記録が 4 ～ 6w データセットに含まれていました。 細胞年齢に関連する生理学的差異は回帰分析によって分析され、グループ差異は ANOVA によって特定され、Holm-Sidak 多重比較検定によって追跡調査されました。 データが非正規である場合、グループの差異は、ダンの事後検定を使用したクラスカル-ウォリス検定によって特定されました。 グラフで示されたデータとの比較を容易にするために、ほとんどの統計分析は図の凡例に記載されています。 すべての分析について、統計的有意性は P < 0.05 として定義されました。 差が統計的に有意である場合、効果の大きさはヘッジズの g 値を計算することによって推定されました。 性差が検査されましたが、一貫した差は観察されなかったため、すべての分析用にデータがプールされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべてのグラフと分析のデータは補足データ 1 として提供されます。

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この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会 (JSS) およびマイケル・スミス健康研究財団 (JSS) によって支援されました。

ブリティッシュコロンビア大学、ジャヴァド・モワファギアン脳健康センター心理学部、バンクーバー、ブリティッシュ・コロンビア州、カナダ

ニコラス・P・ヴィレタ＆ジェイソン・S・スナイダー

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NPV は実験を実施し、データを分析しました。 JSSが資金を提供した。 NPV と JSS は両方とも実験を設計し、論文を執筆しました。

ジェイソン・S・スナイダーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な処理編集者: Karli Montague-Cardoso 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Vyleta、NP、Snyder、JS マウスの若い成人生まれの海馬ニューロンの苔状線維末端における興奮性が増強されているが、成熟した活動電位波形。 Commun Biol 6、290 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04678-5

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受信日: 2022 年 10 月 12 日

受理日: 2023 年 3 月 7 日

公開日: 2023 年 3 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04678-5

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