フェムト秒レーザーによる薄い病理学的サンプル内の腫瘍組織の識別

Apr 07, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9250 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

新しく発見された固形癌性腫瘍の治療では、依然として手術が第一の治療選択肢です。 これらの手術を成功させる重要な要素は、隣接する健康な組織に大きな影響を与えることなく腫瘍を確実に完全に除去するための腫瘍学的安全マージンを正確に特定することです。 今回我々は、がん組織を区別するための代替識別技術として、機械学習アルゴリズムと組み合わせたフェムト秒レーザー誘起破壊分光法（LIBS）を適用する可能性について報告する。 薄く固定された肝臓および乳房の術後サンプルに対するアブレーション後の発光スペクトルが、高い空間分解能で記録されました。 隣接する染色切片は、古典的な病理学的分析による組織同定の基準として機能しました。 肝臓組織に対して行われた原理実証テストでは、人工ニューラル ネットワークとランダム フォレスト アルゴリズムにより、約 0.95 という非常に高い分類精度で健康組織と腫瘍組織の両方を区別することができました。 未知の組織を識別する機能は、さまざまな患者からの乳房サンプルに対して実行され、これも高レベルの識別を提供します。 私たちの結果は、フェムト秒レーザーを使用した LIBS が、術中の外科分野で組織タイプを迅速に識別するための臨床応用に使用できる可能性のある技術であることを示しています。

初期段階で発見されたがんを根絶するための主な攻撃手段は依然として手術です。 新たに診断された固形腫瘍のほとんどは、完全治癒、または少なくとも患者の余命の延長を期待して手術によって除去されます1。 手術後に残ったがん細胞（切除標本の断端陽性など）は、時間の経過とともに局所再発または転移を引き起こす可能性があり、患者の生存率を決定する重要な要素の1つです。 多くの場合、新たに形成された腫瘍組織を除去するためにその後の外科的介入が必要になるか、多くの副作用を伴う補助療法（放射線療法または化学療法）が必要になります。 手術の結果は主に、腫瘍学的介入を行った医療チームの経験によって決まります。目的は、悪性細胞を完全に除去し（さらなる再発を防ぐため）、影響を受けた臓器の機能を低下させずに、できるだけ多くの組織を温存することです。 実際には、腫瘍学的安全マージンは、がんの種類と腫瘍の位置に応じて 2 mm から 1 cm の間で変化します 2。 腫瘍の位置を高精度に特定することは、手術の成功にとって非常に重要です。 外科チームは手術前に画像技術（磁気共鳴断層撮影法、X 線コンピュータ断層撮影法、超音波画像診断法）から得た情報を利用できますが、手術野では主に視覚情報と触覚情報に基づいて判断が行われます。 多くの場合、悪性組織が完全に除去されたかどうかを判断するために、凍結標本に対する術中の病理学的検査が使用されます。 この手術には数十分を要し、不確実性がある場合には手術時間が大幅に長くなり、合併症のリスクが高まります。 このため、手術対象の組織の種類を迅速かつ正確に確立できる代替または補完的な技術が非常に望まれています。

近年、生体内分析のためにいくつかの革新的な技術が研究されています。 組織の局所的な分解から生じるさまざまな分子断片の質量/電荷値を測定する質量分析技術は、さまざまな種類のがんを識別するためにすでに生体内でテストされています3、4、5。 これらと並行して、光コヒーレンストモグラフィー 6,7、ラマン分光法 8,9,10、レーザー誘起ブレークダウン分光法 (LIBS) などの光学技術も、その可搬性と高い空間精度により研究されてきました。 癌組織を検出するために LIBS を使用する最初の試みは 20 年近く前に遡りますが 11、近年の大量の実験データを解釈するための機械学習 (ML) アルゴリズムの開発により、これらの研究は強化されています 12。 LIBS 技術は、材料の表面に焦点を合わせたレーザーによって生成されたプラズマの発光スペクトルを分析します。 複雑な前処理を必要とせず、さまざまなサンプルに対して迅速な結果が得られるという利点があります。 LIBS プロセスでは、材料がイオン化されてプラズマが生成され、冷却すると材料内に存在する化学元素に特有の放射線が放出されます。 さまざまな種類の悪性組織を特定しようとする多くの研究は、ナノ秒レーザー 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 を使用して実施されており、サンプルに重大な熱損傷を与える高温プラズマを生成し、空間解像度の低下23。 これまでの研究で、フェムト秒 (fs) パルスを生体組織 23 および技術サンプル 24 の in situ/in vivo LIBS 解析の精度に使用でき、ミクロンオーダーおよび 25 以下の空間分解能が可能になることを示しました。さまざまな生体組織に関する研究がいくつかの研究で発表されていますが (参考文献 26 およびその中の参考文献)、癌組織の検出におけるその使用についてはあまり研究されていません 12、27、28、29。

この記事では、fs-LIBS および ML アルゴリズムを使用して、標準的なヒト病理サンプル中の肝臓がんと乳がんを特定した結果を紹介します。 超短レーザーパルスの利点を利用して、数ミクロンの厚さの非常に薄いサンプルのアブレーション後の原子および分子の発光スペクトルを記録することができました。 記録されたスペクトルが由来する組織の種類 (ML アルゴリズムのトレーニングと評価に使用) は、隣接するカットの病理学的分析の結果と直接比較することで特定できます。 私たちの知る限り、マイクロメートルの厚さのサンプルに対するこの種の分析は、ns レーザーパルスを使用した消化管腫瘍組織に関する最近の 1 件の研究でのみ実行されました 22。生体組織からの線と重なる線。 超短レーザーパルスと高純度石英基板を使用して、高い空間分解能と低い付随的損傷でアブレーションを実行しました。記録されたスペクトルにはサンプルからの寄与のみが含まれています。

この論文は次のように構成されています。次のセクションでは、実験手順とサンプル調製情報を示します。 次に、肝臓組織を使用して fs-LIBS と ML をテストし、非常に薄い病理学的サンプルから得られたスペクトルを組織の種類の識別に使用できるかどうかを観察します。 また、このセクションでは、異なる日に記録されたデータ間の比較を通じて、測定の再現性が調査されます。 最後のセクションでは、乳がんから得られた結果と、一部の患者に対してすでにトレーニングされたアルゴリズムを別の患者のがん細胞を検出するためにどのように使用できるかを示します。

中心波長785 nmで時間幅30 fs、繰返し数1 kHzのレーザーパルスが、増幅型Ti:Sapphireレーザーシステム(Femtolasers、Femtopower Pro)によって生成されました。 アンプ内でポッケルスセルを（電気光学パルスセレクターとして）使用することにより、繰り返し率がシングルショットまで低減されます。 直線偏光は高精度の自作パルス整形器 30,31 に導かれ、そこでサンプル表面までの光学素子の全体的な分散が 2 光子フォトダイオード信号をフィードバックとして使用して補償されました。 レーザー システムと顕微鏡プラットフォームの間には、パルスのエネルギーを変化させて記録するためのいくつかの光学コンポーネントがあります。 図 1 に、この研究で使用した fs-LIBS セットアップの概略図を示します。 顕微鏡プラットフォームの主なコンポーネントは、サンプルの位置決め用の監視カメラ、ステッピング モーター制御の XYZ 移動ステージ (PI miCos)、およびサンプルの表面をステージの x および y 移動方向と平行にする傾斜ステージです。 。 0.28 の開口数 (NA) と 34 mm の作動距離を備えた 10X Mitutoyo Plan Apo 対物レンズは、レーザー パルスを 3.5 μm の測定ビーム半径 (\(1/{e}^{2}\) の強度で) に集束します。標本、見本。 12 μm 未満のレイリー範囲では、薄い生体サンプル上にプラズマが生成され、基板の材料からのアブレーションが最小限に抑えられます。 測定は、空気雰囲気中、室温で、パルスあたりのエネルギー \(7\pm 0.5 \mu \mathrm{J}\) と、対応するピーク強度約 \(5\times {10}^{14) を使用して実行されました。 }\mathrm{ W}/{\mathrm{cm}}^{2}\)、基板からのスペクトル寄与が非常に低く、良好な信号対雑音比が保証されます。

実験装置の概略図。

組織タイプが事前に特定されたサンプル上の選択された位置ごとに、レーザーのシングルショット領域で 10 × 10 マトリックスをアブレーションしました。 各レーザーパルスによって生成されたプラズマのスペクトルが記録された後、サンプルはスポット間の距離 25 μm だけ移動されました。

レーザー誘起プラズマから放射された光は、顕微鏡の対物レンズの近く 45°に配置された 2 つの石英ガラス レンズのシステムによって NA 0.22 で集光され、光ファイバーを介して分光計の 50 μm 入口スリットに送られました (LOT)。オリエル マルチスペック MS125）。 この実験では、400 本/mm および 500 nm ブレーズの回折格子 (LOT Oriel 77417) を使用しました。これにより、約 1 nm のスペクトル分解能が保証されます。 強化された Roper Scientific PIMAX ICCD を分光計に取り付けてスペクトルを記録しました。 波長校正は、強度校正を行わずに校正ランプ (LOT Oriel Pen Ray 6035 Hg(Ar)) を使用して実行されました。

データ取得はレーザー システムと同期しました。 カメラのプログラム可能なタイミング ジェネレーターは、録画の遅延と露光時間 (ゲート) を ns の精度で制御します。 fs-LIBS 放射の場合、レーザー パルスのスーパーコンティニューム放射と連続体制動放射による広帯域バックグラウンドを抑制するために、レーザー パルス後の 23 ns の遅延と 500 ns のゲート時間を使用しました。 各スペクトルは保存され、組織の種類に応じてラベルが付けられました。

結腸直腸癌の転移を含むヒト肝臓、原発腫瘍のある乳房組織、および転移性乳癌のあるリンパ節のホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルを調査しました。 ミクロトームによって各パラフィンブロックから一連の 10 µm の薄切片を調製し、標準プロトコールに従ってキシレン、アルコール、水でパラフィンを溶解して除去しました 32。 スタックの最も外側のスライスを標準的な H&E (ヘマトキシリンおよびエオシン) プロトコルで染色して、健康な組織と癌性の組織の領域を特定しました (図 2a)。 このようにして、2 枚または 3 枚の LIBS スライドの各セットが 1 対の参照スライドでカプセル化され、染色された外側スライスの光学検査による古典的な病理学的分析を使用して、高い確実性でスペクトル調査のために内側スライス上の対応する位置を選択できます。 約 2 × 1.5 cm の横サイズのスライスを顕微鏡スライド上に置きました。 非常に薄いサンプルの LIBS 分析では、不純物の強いスペクトル線が現れる可能性がある 22 基板の選択が重要な問題となります。 このため、高純度石英ガラス (Plano GmbH) 基板を選択しました。図 3 の挿入図に見られるように、測定されたスペクトル範囲に存在する輝線はシリコン (Si) の輝線のみです。分析された乳房および肝臓の生体組織にはシリコンは無視できる量で存在します 33,34 が、重要な Si 信号を含むスペクトルは基板からのみ発生する可能性があるため除去しました。 基板の問題を回避する (およびより高い信号を得る) 別の方法は、スライスを厚くすることですが、この手順でスライスを取得したり操作したりするのは困難です。

(a) はサンプル調製の概略図、および 2 つの組織タイプ ((b) は肝臓、(c) は乳房) の顕微鏡画像です。 (b) と (c) の赤いマーキングは純粋な腫瘍領域を示し、青いマーキングは純粋な健康な領域を示します。 残りの領域には、腫瘍細胞と健康細胞が混在しています。 (b) の挿入図は、参照画像内の対応する領域に重ね合わされた切除マトリックスの画像を示しています。

両方のクラスの前処理 (ベースライン減算とベクトル正規化) 肝臓スペクトル (赤 = 「腫瘍」、青 = 「健康」)。データセット内の各波長のそれぞれの信号分布が、対応する色の濃淡で示されています。左は、空の基板（石英、緑）と腫瘍肝臓組織（赤）から記録された100のスペクトルの平均を示し、右上のものは、Na線をよりよく視覚化するためにスペクトルの一部を拡大して示しています。

表 1 は、各患者の LIBS サンプルの数と、腫瘍領域と健康領域で記録されたスペクトルの総数を示しています。 患者 3 のサンプルは、リンパ節で増殖した乳房腫瘍組織のみです (健康な乳房組織はありません)。

図 2 は、両方のタイプの組織 (肝臓と乳房) からの 2 枚の参照スライドの画像を示しています。 腫瘍領域は濃い紫色で表され（図 2b および c、赤色のマーク領域）、健康な領域は明るい色で示されます（図 2b および c、青色のマーク領域）。 組織タイプの正しい識別とラベル付けを確実にするために、スペクトル測定はマークされた領域に限定されました。

結果のスペクトルは、後の分析のために対応するクラス (「腫瘍」または「健康」) でラベル付けされます。 実験条件に基づくバイアス（ML 中の）を回避するために、各実験セッション中に各種類の組織からの同程度の数のスペクトルが記録されました。 私たちのアプローチでは、ML は二項分類であり、その目標は、指定されたスペクトルを「腫瘍」と「健康」のクラスに分類することです。 評価では腫瘍の段階の区別は考慮されないことに注意しなければなりません。 また、「健康」クラスでは、組織の種類や細胞の種類は考慮されず、腫瘍細胞が存在しないことだけが考慮されます。 スペクトルの処理と ML アルゴリズムによる分析は、データ マイニング用ソフトウェア アプリケーション、Orange バージョン 3.32.035 を通じて実行されました。

結腸直腸癌の転移を含むヒト肝臓、原発腫瘍のある乳房組織、および転移性乳癌のあるリンパ節のホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルが、ノルデッセン病理学研究所（ドイツ）のアーカイブから回収されました。科学研究倫理委員会の投票への準拠 (Hessische Landesärztekammer 提供、FF61/2014)。 この承認された投票に従って、我々は診断にもはや関係のない過剰な物質を含む10年以上経過した非生命組織サンプルを使用してきました。 このような場合、追加の患者のインフォームドコンセントは必要ありません。

最初のステップとして、ML アルゴリズムのトレーニングとテストは肝臓サンプルからのスペクトルに限定されます。 これらには腫瘍と健康な組織の広い領域が含まれており、記録されたスペクトルを正確に識別してラベル付けするための高い確実性が得られます。 これにより、分析をより複雑なケースに拡張する前に、提案した手法のパフォーマンスのベースラインが得られます。

一連の前処理ステップにより、その後の分析のために取得されたデータが準備されました。 最初に、Orange ソフトウェア内の「ローカル外れ値係数」ウィジェットを使用して、不適切なスペクトルが分類されました。このウィジェットは、隣接するスペクトルに対する特定の記録されたスペクトルの局所的な偏差を測定します (25 の隣接スペクトルに対して 5% の汚染係数を使用しました)。 さらに、288.34 nm の強い Si I スペクトル線を含むスペクトルは、レーザー パルスが溶融シリカ基板もアブレーションしたこと、およびこの波長でのバックグラウンドよりも高い信号と、このスペクトル範囲の最大ランダム ノイズ変動を含むすべてのスペクトルが含まれていることを示しています。も削除されました。 残りのデータについては、3 つの隣接するスペクトルが平均され、データセットが効果的に 3 分の 1 に削減されました。 スペクトルのベースライン減算とベクトル正規化 36 は、レーザーパルスのエネルギーの変動など、記録プロセスからの小さな偏差を修正するために適用されました。 ICCD のネイティブ 1024 ピクセルの全範囲は使用されませんでしたが、CCD センサーのコーナーでケラレが発生したため、両端の 30 ピクセルが削除されました。 最後に、肝臓データセットには、964 個の特徴 (記録されたスペクトルの波長に対応するピクセル) を備えた、「腫瘍」としてラベル付けされた合計 2392 個の平均スペクトルと「健康」としてラベル付けされた平均スペクトル 2544 個が含まれていました。

両方のクラスについて記録されたレーザー誘起発光スペクトルを図 3 に示します。これらは、原子線 37 と分子バンド 38 を表示します。 特定された線とバンドは、他の出版物 15、16、38、39 に示されている生物組織の発光スペクトルと一致します。 他の著者も指摘しているように、fs-LIBS の場合、分子輝線は ns パルスの場合よりも強く、これらのバンドの性質は有機分子と分子の断片化であることは言及する価値があります。参考文献 40 で議論されているような、実験室の周囲雰囲気における炭素と窒素の反応ではありません。 396.8 nm と 393.4 nm の Ca II 二重線は、スペクトル内の唯一のイオン寄与です。 2 つのカテゴリ間のスペクトル (図 3 に示す) の目に見える違いは、Na ラインの強度比ですが、このラインのみの識別は、完全なスペクトル情報を考慮した ML アルゴリズムを使用するほど正確ではありません。より詳細に、より適切な分類を提供します。

さまざまな ML アルゴリズムの次の評価は、肝臓データセットに対する 10 倍交差検証の標準を使用して実行されました。 アルゴリズムのパフォーマンスは、各クラスを個別に検出する能力と、正しい決定の全体的な割合、つまり分類精度 (CA) によって判断されます。

データを分析するために、複雑さと構造が異なるいくつかのアルゴリズム (ナイーブ ベイズ、デシジョン ツリー、サポート ベクター マシン、K 最近傍法、ランダム フォレスト、ニューラル ネットワーク) が選択されました。 それらの CA スコアは 0.85 を超えており、すべてのモデルが組織クラスを正確に識別する非常に優れた能力を示しています。 上位 3 つのアルゴリズム、つまり人工ニューラル ネットワーク (ANN)、ランダム フォレスト (RF)、および K 最近傍 (KNN) は、内部パラメーターを調整することでデータセットに最適に適応され、正しい分類の最高パーセントが得られました。 ANN の場合、1 つの隠れ層に 512 個のニューロン、RF に 250 個のツリー、KNN に 25 個の近傍ニューロンを使用しました。 トレーニングされたアルゴリズムの結果は図 4 にまとめられています。棒グラフは正しい分類の割合を表しています。 ANN モデルと RF モデルは両方のクラスを同じレベルで検出できます (CA スコアは約 0.95)。一方、KNN は腫瘍に対する感度が高くなります (CA スコアは 0.88)。

腫瘍および健康な肝臓組織に対する人工ニューラル ネットワーク、ランダム フォレスト、および K 最近傍法を使用した正しい分類の割合。

提示されたスペクトルは明確な特徴を示しており、どの特徴 (波長) がアルゴリズムの決定に関連するかという疑問が生じます。 このセクションでは、識別におけるスペクトル線の重要性の分析を示します。

このタスクの簡単なアプローチは、クラス (「腫瘍」または「健康」) を入力として使用し、各線の強度が重要性を表す「逆スペクトル」を計算する方法で 1 つのアルゴリズムを逆にすることです。アルゴリズムの決定。 RF とそのデシジョン ツリー ベースの構造により、すべてのツリーの不純物の平均減少を通じて、そのような「逆スペクトル」を計算できます (事実上、各ツリーおよび各波長の各クラスにマッピングされたデータセットがどの程度優れているか) 41。 図 5 に計算結果を示します。 スペクトル線の強度は大きく異なりますが、「逆スペクトル」が記録されたスペクトルに似ていることがわかります。 ナトリウム線は、記録されたスペクトルでその発散強度が観察されたため、アルゴリズムの決定プロセスにとって最も重要性が高く、これは予想通りです。 腫瘍組織における Na 線放射の増加は他の出版物でも議論されており 16,17 、酸性細胞外環境における Na+/H+ 動態の変化に起因する細胞内 Na の増加に起因すると考えられています。 C-N バンドは、実際のスペクトルで 2 番目に高いスコアと 2 番目に高い強度を持ち、C-C バンドとともに、意思決定における分子シグナルの重要性を示しています。 ただし、これらの観察は RF モデルにのみ適用され、他のモデルには必ずしも適用できるわけではないことに言及することが重要です。 それにもかかわらず、それは意思決定プロセスについての洞察を提供し、アルゴリズムがクラスを識別するためにスペクトル線を使用していることを示します。

ランダム フォレスト アルゴリズムの逆スペクトル (各波長の重要度スコア) は、肝腫瘍の平均記録された発光スペクトルと重なりました。

区別が主に原子線とイオン線に基づいている ns-LIBS とは異なり、LIBS で超短パルスを使用すると、分析に分子発光バンドの使用も可能になることを強調します。 ML の入力として原子線または分子バンドのさまざまな組み合わせを使用してスペクトル 42 の次元を削減すると、スペクトル情報全体を使用する場合よりも低い CA が生成されます (結果はこの作業の範囲外です)。そのため、テストはより適切な分類に焦点を当てます。

腫瘍組織を正確に識別する ML アルゴリズムの能力を観察し、意思決定がさまざまな重要度のスペクトル線に基づいていることを証明した後、次のステップは fs-LIBS の再現性を調査し、分析ツールとしてのアプリケーションを確認することです。 。 アブレーションプロセスは複雑で、さまざまな外部パラメータの影響を受けやすいです。 生物組織の LIBS 研究では、その元素組成が非常に不均一であるため、この複雑さはさらに増大します。 この問題を回避するために、多くの研究では、広い焦点を照射に使用して空間分解能を低下させ、付随的損傷を増大させる 13,43,44,45 か、平均化するために多数のスペクトルを使用します 14,15,18。 Fs-LIBS には、イオン化の決定論的な性質とレーザー パルス中のレーザーとプラズマの相互作用がないため、従来の ns-LIBS と比較してより再現性のあるスペクトルを記録できるという利点があります。 データセットの再現性と一貫性の側面については、次のようにアプローチします。肝臓組織の同じサンプルに対して、3 つの異なる日に測定を実行し、各日の設定を個別に最適化しました。 したがって、1 つの組織タイプ内のすべてのアブレーション材料が同じ元素組成を含むと仮定すると、スペクトルは理想的には同じである必要があります。 したがって、ある日に記録されたスペクトルで ML アルゴリズムをトレーニングし、別の日に記録されたスペクトルでテストすると、同じ結果が得られるはずです。 したがって、3 つの最適化されたモデル、KNN、RF、および ANN が、3 つの日次スペクトル サブセットの可能なすべての組み合わせに対してテストされました。 これらのアルゴリズムはすべて、正しい分類の割合が 75% を超え、日々の再現性が良好です。以下では、RF を使用して得られた結果について説明します。 図 6 は、RF アルゴリズムを使用した Tumor クラスと Healthy クラスの正しい予測を示しています。

肝臓組織の測定の再現性。 ランダム フォレスト アルゴリズムを 1 日でトレーニングし、別の日に測定したデータでテストした場合の正しい分類の割合。

さまざまなバーは、アルゴリズムのパフォーマンスの目に見える偏差を示します。 たとえば、腫瘍組織を検出する RF 能力は、「トレーニング 1 日目 - テスト 2 日目」と「トレーニング 1 日目 - テスト 3 日目」の場合では約 20% 異なります。ただし、多くの要因により偏差が予想されます。設定のわずかに異なる調整や生体組織の不均質性などは、モデルのパフォーマンスに影響を与えます。さらに、モデルは 75% を超えるパーセンテージと 0.88 を超える一貫した CA スコア (ここには示されていません) で各クラスを正確に識別できます。データセット内の一貫性。

乳房組織は最も不均一な組織の 1 つです46。 私たちが分析した病理学的サンプルでは、​​腫瘍と健康な組織が明確に識別できる領域は肝臓組織の場合よりも小さかった（図 2 を参照）。 これにより、測定手順がより困難になり、誤ったラベルが貼られる可能性が高まりました。 乳房サンプルは 3 人の異なる患者から提供されたため、1 人の患者のみから得られた肝臓のデータセットと比較して一般化の側面を調査することができました。 乳房の腫瘍と健康な組織のスペクトルは肝臓と似ており、図 7 に示されています。

データセット内の各波長のそれぞれの信号分布を含む、両方のクラス (赤 = 腫瘍、青 = 健康) の前処理 (ベースライン減算およびベクトル正規化) 乳房スペクトル (色付きの影)。 右上の挿入図は、Na 線をわかりやすく視覚化するためにスペクトルの一部を拡大して示しています。

スペクトル線とスペクトル帯域の割り当て、前処理、モデル選択、および微調整は、肝臓データセットと同様に実行されました。 3 つの最適化されたモデル (KNN、RF、および ANN) は、3 人の患者のスペクトルのセット全体を分析した場合、一貫して 0.85 を超える CA スコア (KNN = 0.85、RF = 0.92、および ANN = 0.91) で非常に高いレベルで機能します。

一般化の意味で、未知の患者からの新しいデータを正しく分類するアルゴリズムの能力をテストしました。 このプロジェクトの規模内で、トレーニング プロセスに原発腫瘍を有する 2 人の患者からのデータセットを使用し、3 人目の患者の転移腫瘍を識別するアルゴリズムの能力をテストしました。 トレーニング プールは両方のクラスのスペクトルで構成されていましたが、テスト セットには腫瘍組織のスペクトルのみが含まれていました。 トレーニング段階では 1985 個の腫瘍スペクトルと 2558 個の健康なスペクトルを使用しましたが、新しい患者のテストは 1590 個の腫瘍スペクトルで実行されました。 図 8 は、3 つのモデルからの正しい分類の結果を示しています。

アルゴリズムが他の患者の原発腫瘍に対してトレーニングされた場合の、転移の正しい分類の割合。

99.9 (KNN および RF) および 99.7 (ANN) の割合は、驚くほど優れた予測率を示し、一般化の可能性を示唆しています。 ただし、トレーニングプールは 2 人の患者で構成され、テストプールはリンパ節に乳がん細胞を有する 1 人の患者で構成されているため、より明確な結論を得るには、より多くの患者プールが必要です。

fs-LIBS は石英ガラス基板上の非常に薄いサンプルにも使用でき、生成されるシグナルは腫瘍性肝臓組織と健康な肝臓組織を高い空間分解能で区別するのに十分な強度があることが実証されています。 私たちは、隣接するミクロトームで切断された LIBS スライスと参照スライスを組み合わせて使用​​して、組織の種類を正確に識別しました。 ランダム フォレストと人工ニューラル ネットワーク アルゴリズムが最も優れたパフォーマンスを発揮し、94% 以上のケースで腫瘍と健康な肝臓組織の両方を正確に分類しました。 この場合、K 最近傍アルゴリズムは腫瘍組織の優れた識別を実現しましたが、健康な組織の場合は控えめな結果しか得られませんでした。 RF アルゴリズムを使用して特徴の重要度が計算され、分子バンドとナトリウム ラインが決定プロセスで優先されるという結論に至りました。 分子線の存在は、低エネルギーパルスによるアブレーション後に良好なスペクトル特性を生成する超短レーザーを使用する利点の 1 つを表しています。 これにより、組織タイプの識別が原子線またはイオン線のみに基づいて行われる ns レーザーパルスの場合のような、分子生物学的物質の大量の解離が回避されます 20、22、43。 新しい未知の患者にこの技術を使用する可能性が、非常に優れた分類精度を備えた乳房サンプルで調査されました。

今後は患者数を増やし、サンプル前処理の影響を調べるとともに、組織分化におけるパルス長依存性についても調べていきたいと考えています。 識別精度をさらに高めるために、2 倍の時間遅延フェムト秒パルス 25 を使用して信号対雑音比を改善するとともに、より複雑な数値アルゴリズム 47 が使用されます。 術中分野での応用の可能性では、レーザー源の可用性を考慮する必要があります。その場合、より長いパルス持続時間を備えた高繰り返し率のファイバーレーザーが有望であると思われ48、内視鏡装置にも簡単に統合できます。

私たちは、この方法が標準的な病理学的分析を補完する方法として in situ/in vivo で使用できることを期待しています。

フェムト秒レーザーパルスによるアブレーションの空間精度と必要なサンプル量が少ないことを考慮すると、同じ患者からの生検サンプルで識別アルゴリズムをトレーニングした後、腫瘍の性質と範囲に関する手術内情報を取得できると考えられます。 遠い将来、fs レーザーが手術器具として使用されるようになると、この方法は切開中に健康な組織と病気の組織を直接区別するのに役立つ可能性があります。

現在の研究中および/または研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、実験設定と分析方法の改善にご協力いただいたカッセル大学の Sabrina Schuster、Andreea Cojocaru、Arne Ungeheur、Vladimir Gross 博士に感謝いたします。 PD 医学博士。 クリニクム・カッセルのキア・ホマユンファー医師、医学博士。 ハンナ・ファーナーとrer博士。 いや。 フライブルク大学の Matthias Fahrner 氏は、有益な議論に感謝します。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセスの資金調達。 著者らは、外部資金は一切使用されていないと宣言しています。

カッセル大学物理学研究所、ハインリッヒ・プレット通り 40、34132、カッセル、ドイツ

クリスティアン・サルペ、エレナ・ラメラ・チョボテア、クリストフ・ブルクハルト・モルシャー、バスティアン・ジエリンスキー、ヘンドリケ・ブラウン、アルネ・ゼンフテーベン、トーマス・バウメルト

北ヘッセン病理学研究所、ゲルマニアstr. 7、34119、カッセル、ドイツ

ヨーゼフ・ルショフ

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CS、ERC、CBM が測定を実行し、原稿を執筆しました。 ERC、CBM、BZ がデータを分析しました。 著者全員が批判的な議論に貢献し、原稿を読んで承認しました。

トーマス・バウマートへの手紙。

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転載と許可

Sarpe, C.、Ciobotea, ER、Morscher, CB 他。 フェムト秒レーザー誘起破壊分光法と機械学習による、薄い病理学的サンプル内の腫瘍組織の識別。 Sci Rep 13、9250 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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受信日: 2023 年 1 月 23 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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